استانداردهای مرجع و کالیبراتورها

سیدامید میراحمدی

کارشناس بخش کنترل کیفی-اپلیکیشن شرکت دانش بنیان آپتاسیس

در سنجش های کمّی ارزش یک نمونه سرم درباره یک آنالیت خاص در مقایسه با یک کالیبراتور یا استاندارد سنجیده می شود که برای این کار باید یک آنالیت کاملا خالص به عنوان استاندارد مورد استفاده قرار گیرد. به همین منظور یکی از مسائل بسیار مهم در سنجش های ایمنی تهیه استاندارد و کالیبراتور مناسب است.

انواع استانداردها

احتمال دارد سنجش ایمنی برای آنالیتی که تاکنون اندازه گیری نشده است طراحی گردد، درنتیجه استاندارد مرجعی در خصوص این آنالیت وجود ندارد. در این موارد شرکت های سازنده کیت برای بدست آوردن استاندارد نیازمند ترکیباتی با کیفیت بالا، پایداری بلند مدت و خلوص زیاد می باشند که در دسترس باشد و اغلب برای استانداردسازی بکار گرفته شود.

سه نوع از چنین فرآورده های مرجعی بطور شایع در استاندارسازی کیت های سنجش ایمنی کاربرد دارند.

1. استانداردهای بین المللی(International Standard)

برای کالیبراسیون یک آنالیت بیولوژیک باید از یک استاندارد بین المللی (IS) یا یک فرآورده مرجع بین المللی International Reference Preparation (IRP) استفاده شود. مواد مورد نیاز برای چنین استاندارهایی توسط WHO جمع آوری، تست و توزیع می شود. در حقیقت شاخه ای از WHO به نام آزمایشگاه بین المللی برای استانداردها و کنترل های بیولوژیک(ILBSC)  این استانداردها را تهیه می کند.IRP شاید مشابه IS نباشد اما جهت استاندارد کردن یک روش مفید می باشد.

بسیاری از این استانداردها امروزه در انستیتو ملی کنترل و استانداردهای بیولوژیک (NIBSC) در انگلستان تولید می شوند.

لازم به ذکر است که استانداردهای بین المللی برای استفاده روتین به عنوان استاندارد کار(Working Standard) به مقدار کافی در دسترس نمی باشد.

2. مواد مرجع(Reference Material)

این مواد مشابه IS تحت آزمایشات و تست های تخصصی قرار نمی گیرند ولی اطلاعات مربوط به خلوص و توانایی آنها توسط سازنده ی آنها ارائه می شود.

این مواد نیز توسط برخی از مراکز نظیر بخش استاندارد های بیولوژیک و مرکز تحقیقات پزشکی در لندن توزیع می گردد.

فراورده مرجع به ویژه برای موارد زیر مفید است:

• زمانی که یک ماده نمی تواند به طور کامل به وسیله روش های شیمیایی و فیزیکی مشخص شود
• مواد هتروژن نظیر گلیکوپروتئین ها
• دشواری در جداسازی و تخلیص نظیر پپتیدهای صنعتی
• از نظر اقتصادی گران باشد نظیر برخی از هورمون ها
• در طی فرایند جداسازی ناپایدار بوده و یا به سرعت تغییر ماهیت دهد نظیر هورمون رشد

3. استانداردهای مرجع کار(Working Reference Standard)

این مواد در شرکتهای سازنده و آزمایشگاه‌ ها تولید می شود، بدون اینکه در مورد توانایی واقعی آنها ارزیابی صورت گرفته باشد. به طور شایع این مواد در مقابل یک کالیبراتور IS کالیبر می شوند.

4. استاندارهای کار(Working Standard)

استانداردهای کار مهمترین شکل از استاندارد است که به عنوان پایه و اساس صحت سنجش های روتین به کار میرود. تست های معتبر سازی که برای یک استاندارد مرجع مورد نیاز است به طور طبیعی برای استاندارد کار مورد نیاز نمی باشد، با این حال سازنده استاندارد باید مسئولیت کیفیت مناسب این مواد را برعهده داشته باشد. این استانداردها به طور طبیعی در حجم های زیادی ساخته می شوند.

آماده سازی استانداردها

آماده سازی استانداردهای بین المللی از نمونه های لیوفلیزه نیازمند دقت زیادی است و نباید توسط افراد بی تجربه انجام شود. صحت وسایل برای تقسیم نمودن محلول بسیار اهمیت دارد و بهتر است که از وسایل نو استفاده شود. یک سری از استانداردهای مرجع کار با غلظت های مختلف به سادگی با رقیق کردن IS در یک ماتریکس مناسب تهیه می شود. این استاندارد ها دارای غلظت های بالاتر از حدی است که برای روش سنجش ایمنی لازم است درنتیجه استانداردهای مورد نیاز با مخلوط کردن حجم های مناسب از این استاندارد با یک ماتریکس عاری از آنالیز تهیه می شود.

در راستای اندازه گیری یک آنالیت در نمونه ، روش سنجش ایمنی اغلب نیازمند استفاده از کالیبراتور است که به طور معمول 6-4 کالیبراتور برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده می شود. کالیبراتورها یا استانداردهای کار می‌توانند در حجم های زیاد تهیه شوند.

بهتر است برای به حداقل رساندن ریسک کالیبراسیون نامناسب مربوط به ناهمگونی میان سنجی که منجر به عدم صحت خواهد شد، سنجش توسط افراد مختلف و در چندین سری کاری و در دوره‌های زمانی مختلف انجام شود.

اثرات ماتریکس(Matrix Effects)

انتخاب یک حلال مناسب برای کالیبراتور ها اغلب یک مشکل اساسی در فرمولاسیون محرک های تشخیصی است. صحت سنجش ایمنی وابسته به مقایسه نمونه های بالینی با استانداردی است که مقادیر مختلفی از آنها را داراست.

اعتبار چنین مقایسه‌ای وابسته به یکسان بودن نمونه و استاندارد می باشد، با این استثناء که استاندارد دارای غلظت های متفاوتی از آنالیز است؛ بنابراین استاندارد باید در یک ماتریکس تهیه شود که هم شبیه به نمونه باشد و هم در واکنش آنتی بادی به آنالیت تداخل ننماید. به عنوان یک قانون عمومی، تمام واکنش های اتصال آنتی بادی - آنتی ژن توسط ماتریکسی که در آن تهیه می شوند تحت تاثیر قرار می گیرد. با این حال چنین تداخلاتی از یک سنجش به سنجش دیگر متفاوت است. زمانی که نتایج تحت تاثیر نوع حلال مورد استفاده قرار می گیرد ضروری است که استاندارد ها در مواد دیگری که مشابه نمونه سرم هستند تهیه شوند. در زمینه بالینی، ماتریکس های مختلفی برای آنالیز های مختلف استفاده می شود. رایج‌ترین ماتریکس های مورد استفاده شامل یک پولد سرم انسانی است که دفیبرینه شده و لیپیدهای آن نیز خارج شده است و یا پلاسمایی است که به طور فیزیولوژیک و پاتولوژیک دارای غلظت های پایینی از آنها آنالیت است. چنین نمونه هایی باید برای وجود ویروس HIV و هپاتیت B و C چک شوند. اما مشکل اصلی در تهیه کالیبراتور صفر است که برای تهیه سرم عاری از آنالیت روش های سخت و متعددی مورد نیاز می باشد. علاوه بر این از سرم سایر حیوانات یا محلول های بافری حاوی پروتئین نیز می توان برای تهیه کالیبراتور ها استفاده نمود.

ارزیابی نیمه عمر

پایداری عبارت است از مدت زمانی که در طول آن شاخص های اجرائی محصول در شرایط  نگهداری ویژه آن پایدار باشند. تغییر در کیفیت یک محصول در طول زمان وابسته به درجه حرارت نگهداری، رطوبت، نوع بسته بندی و فرمولاسیون آن است.

سه نوع پایداری برای معرف های تشخیصی با اهمیت است:

1. پایداری فیزیکی
2. پایداری باکتریو استاتیک
3. پایداری شیمیائی یا عملکردی

با توجه به بررسی شاخص های تضمین کیفیت، سازندگان کیت باید محصولی ارائه کنند که حداقل 90 درصد ارزش اولیه خود را در سراسر دوره پایداری حفظ کرده و بازیافت نماید.

منحنی استاندارد یا کالیبراسیون

در روش های کمّی سنجش ایمنی، دو متغیر اصلی غلظت آنالیت (دوز) و میزان سیگنال (پاسخ) وجود دارد؛ برای تعیین غلظت آنالیت در یک نمونه از منحنی کالیبراسیون استفاده میشود که سیگنال در محور Y و غلظت کالیبراتور در محور X رسم میگردد.

کالیبراسیون فرآیند برقراری یک ارتباط شفاف بین دوز و پاسخ است. به دلیل این که از محلول های استاندارد برای رسم منحنی کالیبراسیون استفاده می شود چنین منحنی هایی را منحنی استاندارد نیز می نامند. علاوه بر این چون این منحنی ارتباط بین دوز و پاسخ را نشان می دهد به منحنی دوز-پاسخ(Dose Response Curve)  نیز معروف است.

منابع:

الایزا-واحد تحقیق توسعه شرکت پیشتاز طب-انتشارات میرماه

Basic Calibration of UV/ Visible Spectrophotometer Adeeyinwo, C.E,1 Okorie, N. N.2 , Idowu, G. O.3 1,2 Department of Chemistry, Federal University of Technology Akure. 2,3 Engineering Materials Development Institute Akure.