مقدمه‌ایی بر نورتابی شیمیایی و آنزیم‌های مورد استفاده در آن

دکتر فرشید یگانه

دانشیار ایمونولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی

مشاور علمی شرکت دانش بنیان آپتاسیس

نورتابی یا لومینسانس (Luminescence) پدیده‌ای طبیعی است که امروزه کاربردهای متعددی در آزمایشگاه‌های پزشکی و پژوهشی دارد. پدیده لومینسانس به‌عنوان انتشار نور مرئی یا نزدیک به مرئی (k = 300-800 نانومتر) از یک ماده در نتیجه برگشت الکترون از حالت برانگیخته به حالت پایه ایجاد می‌شود. در این حالت یک فوتون آزاد می‌شود سپس، این فوتون توسط ابزار اندازه‌گیری لومینسانس تشخیص داده می‌شود یا مستقیماً با چشم مشاهده می‌گردد. اشکال مختلفی از پدیده لومینسانس مورد شناسایی و استفاده قرار گرفته‌اند که از آن جمله می‌توان به Bioluminescence، Chemiluminescence و Photoluminescence اشاره نمود. تفاوت اصلی همه این روش‌ها در نحوه رسیدن ملکول به‌حالت برانگیختگی می‌باشد. در روش‌های تشخیصی آزمایشگاهی بیشتر از کمی لومینسانس یا نورتابی شیمیایی استفاده می‌شود، که بر پایه واکنش‌های شیمیایی اگزرگونیک یا گرمازا (واکنش اگزرگونیک واکنشی است که انرژی آزاد می‌کند) صورت می‌پذیرد و سبب می‌گردد تا واکنش خودبخودی و بدون دریافت انرژی از محیط پیش رود.

تولید و گسیل نور در روش‌های لومینسانس می‌تواند به دو صورت فلَش و درخشش صورت پذیرد. لومینسانس فلَش سیگنال بسیار روشنی را برای مدت زمان کوتاهی، معمولاً چند ثانیه، ساطع می‌کند. در مقابل، لومینسانس درخشش سیگنال پایدارتر اما معمولاً با شدت کمتری منتشر می‌کند که می‌تواند چندین دقیقه یا چند ساعت طول بکشد. لومینسانس فلَش به یک سیستم تشخیص مجهز به انژکتور نیاز دارد که بتواند کمی قبل از اندازه‌گیری، سوبسترا را به ویال انجام واکنش تزریق نماید تا سیگنال به موقع ثبت شود. اما در مورد واکنش‌های درخشش، زمان افزودن معرف و اختلاط معرف/نمونه به اندازه واکنش‌های فلش حیاتی نیست. بنابراین، از مزایای نورتابی شیمیایی درخشش می‌توان به حساسیت بالاتر، دامنه دینامیکی گسترده‌تر و عدم نیاز به تجهیزات ویژه مجهز به انژکتور اشاره نمود.

از دیدگاه دیگری نیز می‌توان واکنش‌های کمی‌لومینسنس را دسته‌بندی نمود. به‌طور کلی یک واکنش کمی‌لومینسانس می‌تواند از طریق دو مکانیسم اساسی (مستقیم و غیر مستقیم) ایجاد گردد. در واکنش مستقیم دو ماده (به‌طور معمول سوبسترا و اکسیدانت) در حضور یک کوفاکتور واکنش داده و یک محصول یا ماده حدواسط را ایجاد می‌کنند. در این حالت بخشی از محصول به حالت برانگیخته تبدیل شده و سپس با انتشار فوتون به حالت پایه برمی‌گردد و همین امر مسئول انتشار نور می‌باشد.

در روش غیرمستقیم از مولکول‌هایی استفاده می‌شود که به‌طور مستقیم نورتابی ندارند، در این حالت، بعد از برانگیخته شدن این ملکول، الکترون آزاد شده از آن به یک ملکول فلوروفور انتقال می‌یابد. فلوروفور با دریافت الکترون از ماده اول به حالت برانگیخته در آمده و زمانی که به سطح پایین انرژی برمی‌گردد فوتون‌های نور را آزاد می‌نماید.

البته حالت سومی نیز وجود دارد که تحت عنوان الکترو کمی‌لومینسنس (ECL) شناخته می‌شود. در واقعECL  یک روش کمی‌لومینسانس است که با واکنش‌های الکترو شیمیایی انجام می‌شود. در ECL واکنشی که به تولید نور می‌انجامد با جریان الکتریکی آغاز و با قطع آن خاتمه می‌یابد و محصول نهایی این واکنش نور است.

اکثر واکنش‌های نورتابی شیمیایی، واکنش‌های اکسیداسیون هستند، زیرا تولید نور مرئی به واکنش‌های بسیار پرانرژی نیاز دارد (3/71 کیلو کالری در مول برای نور مرئی در 400 نانومتر و 38 کیلو کالری در مول برای نور در 750 نانومتر). در ادامه به توصیف معروف‌ترین ملکول‌ها و آنزیم‌هایی که در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی برای اندازه‌گیری آنالیت‌ها استفاده بر پایه نورتابی شیمیایی می‌شود می‌پردازیم.

 لومینول (Luminol): لومینول به‌دلیل در دسترس بودن و قیمت پایین، یکی از پرمصرف ترین ترکیبات نورتابی شیمیایی است. لومینول (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione)  به‌صورت یک پودر جامد کریستالی زرد رنگ است که در اکثر حلال‌های آلی قطبی محلول است، اما در آب نامحلول است. لومینول به نور بسیار حساس است و در اثر واکنش با عوامل اکسید کننده قوی، اسیدهای قوی، بازهای قوی و عوامل احیاء کننده قوی دچار تغییر شده و عملکرد خود را از دست می‌دهد. همچنین، محلول‌های لومینول از نظر حرارتی ناپایدار هستند. بنابراین، باید آنها را از دمای بالا محافظت نمود. محلول قلیایی لومینول توسط عوامل اکسید کننده، مانند ازن، هالوژن‌ها، اکسیژن رادیکال، پرسولفات‌ها، هیپوکلریت‌ها، یا H₂O₂ و K₃Fe(CN)₆ اکسید شده که باعث نورتابی شیمیایی در λ_max برابر با 425 نانومتر می‌گردد. توجه شود که شرایط قلیایی قوی ممکن است باعث دناتوره شدن پروتئین‌های موجود در محیط از جمله آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌ها شود. بنابراین، معمولاً به‌جای استفاده از عوامل اکسید کننده، استفاده از پراکسیدازها ترجیح داده می‌شوند زیرا می‌توانند لومینول را در شرایطی که از نظر قلیایی بودن ملایم‌تر است نیز اکسید کنند. برای این منظور، لومینول در حضور کاتالیزورها مانند پراکسیداز ترب کوهی (HRP)، لاکتو پراکسیداز و میلو پراکسیداز توسط عواملی مانند پراکسید هیدروژن اکسید شود. مهم‌ترین و پرکاربردترین سیستم ترکیبی آنزیم - اکسید کننده، ترکیب HRP-Luminol-H₂O₂ است که در بسیاری از سنجش‌های نورتابی شیمیایی استفاده می‌شود و به‌شدت درخشندگی لومینول را افزایش می‌دهد.

استر آکریدینیم (Acridinium ester): قرار گرفتن استر آکریدینیم در معرض محلول قلیایی پراکسید هیدروژن باعث ایجاد فلش نور می‌شود. امروزه بیشتر از استر سولفونامید آکریدینیم استفاده می‌شود. هنگامی که با H₂O₂ قلیایی واکنش می‌دهند، استرهای فنیل آکریدینیم یک فلش آبی شدید در طول موج حدود 440 نانومتر منتشر می‌کنند. ترکیبات نشاندار شده با آکریدینیم در مقایسه با ترکیبات نشاندار شده با لومینول، 100 برابر شدت نورتابی شیمیایی قوی‌تر دارند. همچنین، استرهای آکریدینیم این ویژگی برجسته را دارند که نورتابی آنها یک واکنش شیمی ساده است و نیازی به دخالت آنزیمی نیست.

همانطور که در بالا اشاره شد، در واکنش‌های کمی‌لومینسانس غیر مستقیم از آنزیم بهره می‌برند. پرکاربردترین آنزیم‌ها شامل HRP و آلکالین فسفاتاز (ALP) هستند که هر کدام سوبستراهای مخصوص به خود را دارند.

1. آنزیم ALP: در حال حاضر طیف متنوعی از سنجش‌های نورتابی شیمیایی با استفاده از سوبستراهای آلکالین فسفاتاز (EC 3.1.3.1) انجام می‌شوند. حساس‌ترین آنها بر پایه استفاده از دو سوبسترای (AMPPD) و(CSPD) می‌باشد. آلکالن فسفاتاز این سوبستراها را دفسفریله می‌کند تا یک ماده واسطه فن‌اکسید تولید کند و برای تولید نور در طول موج 470 نانومتر تجزیه می‌شود. تابش نور یک درخشش طولانی مدت (بیش از 1 ساعت) ایجاد می‌کند. بنابراین این سیستم را به یک سیستم ایده آل برای استفاده با روش‌های ایمنی مبتنی بر غشاء تبدیل می‌کند (مانند وسترن بلات).
2. آنزیم HRP: لومینول یک سوبسترای بسیار متداول برای HRP می‌باشد. HRP تجزیه لومینول را در حضور پراکسید هیدروژن کاتالیز می‌کند. فلاش‌های نور مرئی (حداکثر در 425 نانومتر) پس از برگشتن ملکول از حالت برانگیخته به حالت پایه ساطع می‌شود. پرکاربردترین مشتق لومینول (5 - آمینو - 2،3 - دی هیدرو - 1،4 - فتالازین دیون) است.

از دیگر آنزیم‌های مورد استفاده در نورتابی شیمیایی می‌توان به Galactosidase، Glucose oxidase، Glucose-6-phosphate dehydrogenase، β-N-Acetylglucosaminidase، Invertase و Xanthine Oxidase اشاره نمود که استفاده از آنها بیشتر محدود به پژوهش‌ها می‌باشد.

بازده کوانتومی کمی‌لومینسانس‌های مورد استفاده در آزمایشگاه در شرایط عادی بسیار پایین و در نتیجه برای استفاده در تشخیص ناکارآمد است. به‌طور مثال، بازده کوانتومی واکنش لومینول در حدود 2/1 درصد است. در حالیکه، واکنش‌های دیگر بازده کوانتومی بالاتری نسبت به واکنش لومینول دارند، به‌طور نمونه، اکسیداسیون بیس (2،4،6 - تری کلروفنیل) اگزالات بازده 27 درصد دارد. برخی از واکنش‌های طبیعی، مانند واکنش لوسیفراز کرم شب‌تابی بازده کوانتومی بیش از ۸۸ درصد دارند. به‌منظور بهبود سیگنال‌های لومینسانس و افزایش حساسیت، از تقویت کننده‌ها (Enhancers) استفاده می‌شود. تقویت کننده‌ها با افزایش شدت و زمان سیگنال‌ها، باعث افزایش بازده می‌شوند. بازده کوانتومی نورتابی شیمیایی که با Φ_CL نمایش داده می‌شود حاصلضرب سه جزء است:     Φ_CL = Φ_C × Φ_EX × Φ_F

Φ_c: کسری از مولکول‌ها که وارد مسیر واکنش نورتابی شیمیایی می‌شوند

Φ_EX: کسری از مولکول‌ها که به‌صورت الکترونیکی برانگیخته می‌شوند

Φ_F: بازده کوانتومی فلورسانس ساطع کننده در حالت برانگیخته

از بین تقویت کننده‌های رایج می‌توان به فنولیک و مشتقات آن، مشتقات N-phenoxazine، D-luciferin، فروسیانید و یون‌های فلزی اشاره نمود. فنولیک و مشتقات آن (به ویژه هالوژن فنلی حاوی 4 فنلی) نسبت به سایر تقویت کننده‌ها کارایی نسبتاً بالایی دارند.

لازم به ذکر است که در تولید کیت‌های تشخیصی از هر سه روش کمی‌لومینسنس مستقیم، کمی‌لومینسنس غیر مستقیم و الکترو کمی‌لومینسنس برای تولید سیگنال استفاده می‌شود. در ایران در حال حاضر، کیت‌های کمی‌لومینسنس شرکت دانش بنیان آپتاسیس بر پایه روش غیر مستقیم و با استفاده از آلکالین فسفاتاز و سوبسترای AMPPD تهیه می‌گردد. بهره‌مندی از این روش ساده نیاز به دستگاه‌های پیچیده‌تر را مرتفع ساخته و کارایی روش را افزایش می‌دهد.